何應欽、白崇禧以軍事委員會參謀總長、副參謀總長的名義發出“皓電”，強令黃河以南的八路軍、新四軍限期一個月撤至黃河以北。要求把58萬的八路軍、新四軍縮編為10萬人，取消陝甘寧邊區及其他根據地。中國共產黨為了顧全抗日的大局，表示願將皖南新四軍部隊開赴長江以北。
1941年1月4日，葉挺、項英率新四軍軍部，一個教導團、一個特務團和第1、2、3支隊的各兩個團，共9000餘人，從涇縣的雲嶺起程，向茂林前進。
而這時，蔣介石圍殲新四軍皖南部隊的軍事部署正在悄悄進行。顧祝同根據蔣介石的密令，於1940年10月就將第32集團軍總部由江西臨川調至皖南寧國，並指示上官雲湘負責指揮圍殲新四軍皖南部隊。至12月底，上官雲湘已集結了七個師約8萬兵力，在涇縣、茂林一帶布成口袋形，準備包圍聚殲葉挺、項英部。
1月4日晚，皖南新四軍兵分三路向南進發。由於下雨，加上黑夜、路滑和過重的負荷，部隊5日才到達茂林以南的潘村駐地。由於疲勞過度，掉隊人數增多，軍部決定留原地休息。
6日黃昏，新四軍各縱隊按照計劃向榔橋、星潭方向開進。
7日拂曉，第2縱隊在行軍途中透過丕嶺時，遭到國民黨軍第40師一個連的攔擊。前衛部隊將其擊退後，繼續向星潭前進。但星潭已為國民黨第40師佔領，我前進受阻，雖經激烈戰鬥，但沒有攻下。
8日晚，上官雲湘命令各部發動第一次總攻。軍部首長決心改道由茂林方向突圍，仍由銅陵、繁昌之間北渡。
9日，雙方在茂林以東20裡處的高坦展開激戰，並形成對峙。槍彈聲、風雨聲響成一片，形勢十分嚴峻。為了振奮官兵士氣，葉挺軍長親臨前線指揮作戰。在葉挺軍長的指揮下，部隊以步槍、手榴彈打退了國民黨軍成連、成營的輪番進攻，迫使氣焰囂張的敵軍114師龜縮茂林。
黃昏，葉挺軍長率第2縱隊、第3縱隊及軍直全部人員撤出高地，向東北方向突圍。山路極其狹窄、崎嶇，軍長同大家一樣步行。10日拂曉，走到石井坑。當天，上官雲湘集中了五個師，向石井坑發起了試探性進攻，被我擊退。11、12日，上官雲湘向新四軍發動兩次進攻，均被新四軍擊潰。
13日下午，國民黨軍向我發起第三次進攻。他們憑著火力的優勢，反覆向我衝擊，我各部隊頑強抗擊，陣地反覆爭奪，彈藥不濟，就與敵軍展開白刃戰。終因頑眾我寡、彈藥不濟，我軍主要陣地被突破。黃昏，軍首長決定，剩餘部隊兵分兩路向北向西突圍。一時間，機槍聲、手榴彈的爆炸聲以及衝殺聲震動了整個山谷，大家只有一個信念，衝出去，殺開一條血路到江北去。葉挺指揮部隊，奮力擊敵，終因兵力懸殊，我軍彈盡糧絕，傷亡殆盡。
新四軍皖南部隊近萬人，除前後約2000人分散回到新四軍其他部隊外，大部分壯烈犧牲或被俘。政治部主任袁國平殉職，軍長葉挺下山與上官雲湘談判被扣，副軍長項英、副參謀長周子昆被叛徒殺害。皖南新四軍蒙受重大損失。
1月17日，蔣介石甘冒天下之大不韙，宣佈新四軍為“叛軍”，取消新四軍番號，並將葉挺交“軍法審判”。國民黨的第二次反共高潮達到了登峰造極的地步。
事變發生後，中共中央領導全黨全軍對國民黨反動派進行了針鋒相對的鬥爭。1月20日，中央軍委釋出命令，重建新四軍軍部，任命陳毅為新四軍代軍長，將新四軍整編為7個師和1個浙東縱隊，繼續堅持大江南北的抗日戰爭。1月22日，中共中央發言人發表談話，嚴厲駁斥了蔣介石取消新四軍番號的命令，號召全國人民團結起來和頑固派作鬥爭。當時在重慶的我黨代表周恩來向國民黨當局提出了嚴重抗議，並同國民黨展開了尖銳鬥爭。1月18日，重慶《新華日報》上發表了周恩來的親筆題字：“為江南死難者誌哀”，“千古奇冤，江南一葉；同室操戈，相煎何急。”延安《新中華報》也發表了《抗議無法無天之罪行》的社論。
皖南事變真相揭露後，引起了國內外廣大愛國人士的震驚。1月11日，國民黨民主愛國人士宋慶齡、柳亞子、何香凝、彭澤民致書蔣介石，要求國民黨當局“慎守總理遺訓，力行我黨國策，撤銷剿共部署，解決聯共方案，發展各種抗日實力，保障各種抗日黨派。”海外著名華僑人士陳嘉庚、司徒美堂也發表通電或致電蔣介石，反對蔣倒行逆施。英美方面也擔心中國的團結破裂後不能牽制日本。美國政府特使居里正式向蔣介石表示，美國在國共關係未解決前，